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塑料作為一種廣泛應(yīng)用于生活中的材料，其優(yōu)異的性能特點如重量輕、加工性好、耐用性強以及低成本等,使其成為不可或缺的日用品。然而,傳統(tǒng)的石油基塑料由于難以降解,在大量使用和廢棄的過程中，造成了嚴重的環(huán)境污染問題,引發(fā)了人們的廣泛關(guān)注。因此，生物工程師們一直在努力開發(fā)可替代石油基塑料的生物降解性塑料。

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其中，聚羥基烷酸酯(PHAs)作為一種可生物降解的聚合物，受到了廣泛關(guān)注和研究。PHAs是由多種微生物合成并在細胞內(nèi)積累的聚合物，可作為碳、能量和還原力的儲存材料。與傳統(tǒng)的石油基塑料相比,PHAs具有良好的生物降解性,在環(huán)境中能夠被微生物分解,不會對生態(tài)環(huán)境造成長期污染。然而,天然產(chǎn)生的PHAs并不能完全滿足當代塑料市場的性能需求,如機械強度、熱穩(wěn)定性等方面存在一定的局限性。為此,人們致力于通過修改PHAs的單體組成或引入新型單體來豐富其性能特點,使其能夠更好地替代傳統(tǒng)塑料。

引入芳香族側(cè)鏈單體是一個頗有前景的研究方向，芳香族側(cè)鏈相芳烴可以提高PHAs的熱穩(wěn)定性,從而實現(xiàn)更廣泛的應(yīng)用。這些含有芳香族重復單元的PHAs,有望取代傳統(tǒng)的不可生物降解的石油基芳香族塑料,如聚苯乙烯（PS）和聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)等。然而,目前對芳香族PHAs的研究與脂肪族PHAs相比仍處于相對初級階段,主要存在以下兩個方面的挑戰(zhàn):

一、缺乏關(guān)于產(chǎn)生芳香族羥基輔酶A的代謝途徑的知識。芳香族羥基輔酶A是PHAs聚合的必要中間體,但目前對其代謝機制的了解還比較有限。

二、能夠聚合芳香單體的PHA合成酶在自然界中比它們的脂肪類合成酶要少得多。這使得芳香族PHAs的生產(chǎn)主要依賴于向培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的芳香族前體,而這些前體通常是有毒且昂貴的。

在這項研究中,研究人員通過以下三種策略對大腸桿菌進行代謝工程改造,以生產(chǎn)聚(PhLA)并顯著提高聚(3HB-co-PhLA)的產(chǎn)量。

首先，在一株大腸桿菌菌株中建立了一條由葡萄糖合成聚(PhLA)的代謝途徑。同時,通過引入來自天然生產(chǎn)PHA的生物體的PHA顆粒結(jié)合蛋白,提高了這種芳香族聚酯的積累。

其次，對大腸桿菌的中心碳代謝和山梨酸途徑進行代謝工程改造,以增加向PhLA的代謝通量。通過進一步的基因修飾,基于多次批次發(fā)酵的結(jié)果,開發(fā)出一株最優(yōu)化的大腸桿菌菌株。

最后，通過對關(guān)鍵的聚合酶PHA合酶PhaC1437進行工程改造,以提高聚(PhLA)的合成。

一、PhLA代謝途徑的構(gòu)建

聚苯乳酸(poly(PhLA))的生產(chǎn)最初是基于大腸桿菌(E. coli)XB201TBAF菌株實現(xiàn)的。該菌株通過兩個質(zhì)粒建立了poly(PhLA)生產(chǎn)的代謝途徑:一個質(zhì)粒用于增強向苯乳酸(PhLA)的代謝通量,另一個質(zhì)粒用于建立PhLA聚合的代謝途徑。這種改造菌株被命名為TBAFp,成功生產(chǎn)了poly(PhLA),但積累量較低(2.56 ± 0.69 wt%)。

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為了提高聚合物產(chǎn)量,他們引入了來自天然PHA生產(chǎn)菌的PHA顆粒結(jié)合蛋白(phasins)。phasins在PHA的形成、分裂和穩(wěn)定化過程中起關(guān)鍵作用。選擇了三種代表性PHA生產(chǎn)菌株的phasins進行評估:C. necator的PhaP1、P. putida和P. oleovorans的PhaI。結(jié)果顯示,表達P. oleovorans phaI和P. putida phaI的菌株,其聚(PhLA)的滴度和含量均有所增加。

為進一步提高聚合物積累,他們調(diào)節(jié)了phasins基因的表達。在C. necator中,PhaR可以結(jié)合到phaP1的上游區(qū)域調(diào)控其表達;在P. putida和P. oleovorans中,PhaF具有DNA結(jié)合域和PHA顆粒結(jié)合域。他們分別表達了phaR、phaP1和phaR、phaIF操縱子,發(fā)現(xiàn)共表達這些基因的菌株聚合物產(chǎn)量和含量明顯提高。尤其是表達P. putida PhaIF操縱子的菌株,生產(chǎn)了0.28 ± 0.02 g/l的聚(PhLA),PHA含量為19.59 ± 1.22 wt%。

他們還嘗試使用合成Anderson啟動子來表達表殼蛋白基因,但未觀察到聚合物積累的顯著增加。目前,通過額外表達phaR或phaF進行基因調(diào)控是提高聚(PhLA)積累的最有效方法。因此,選擇攜帶P. putida PhaIF操縱子的TBAFp菌株(命名為TBAFpp)進行進一步研究。在TBAFpp菌株的補料分批發(fā)酵中,產(chǎn)生了0.8 ± 0.0 g/l的聚(PhLA),PHA含量為11.2 wt%。

因此，通過引入phasins基因并對其表達進行調(diào)控,成功地提高了大腸桿菌生產(chǎn)聚苯乳酸的能力。這為未來進一步優(yōu)化和工業(yè)化生產(chǎn)聚苯乳酸奠定了基礎(chǔ)。

二、優(yōu)化PhLA代謝通量

首先,研究人員構(gòu)建了一種不需要氨基酸補充即可生長的TLF菌株,并通過調(diào)控aspC和tyrB基因的表達來提高PhLA的產(chǎn)量。TLF17B菌株經(jīng)過優(yōu)化后,在無需氨基酸補充的情況下,PhLA產(chǎn)量達到了0.63 g/L,超過了需要氨基酸補充的原始菌株。

進一步,研究人員構(gòu)建了TLF17Bpp菌株,能夠生產(chǎn)含有20.31 wt%聚苯乳酸的聚羥基脂肪酸(PHA)。在發(fā)酵過程中,該菌株的聚苯乳酸產(chǎn)量達到了2.0 g/L,明顯高于需要氨基酸補充的原始菌株。

為了實現(xiàn)無誘導劑生產(chǎn),研究人員構(gòu)建了TLF17BP菌株,通過整合pheA^fbr基因到基因組中,實現(xiàn)了對聚苯乳酸生物合成通路的代謝調(diào)控。該菌株在無需IPTG和氨基酸補充的條件下,聚苯乳酸產(chǎn)量達到了2.3 g/L,PHA含量為13.6 wt%。

最后,通過增強PEP合酶的表達和敲除pykF基因,進一步提高了碳通量向shikimate通路的流向,構(gòu)建了TLF17BPApp菌株。該菌株在發(fā)酵條件下,聚苯乳酸產(chǎn)量達到了2.7 g/L,PHA含量為24.32 wt%,顯著優(yōu)于前述菌株。

三、PHA合成酶工程

為進一步提高聚合物的生產(chǎn),研究人員對PHA合成酶(PhaC)進行了工程改造,以增強其聚合能力。之前的研究主要集中在修改PhaC以生產(chǎn)具有特定單體組成的PHA,包括poly(3-羥基丁酸-co-中鏈3-羥基烷酸)、PLA和poly(3-羥基丁酸-co-乳酸)。由于用于生產(chǎn)poly(PhLA)的PhaC1437的3D結(jié)構(gòu)尚未知,研究人員采用了基于預(yù)測3D結(jié)構(gòu)的理性突變方法,成功地進化了PhaC1437,使其更適合于PhLA的聚合。

具體來說,研究人員首先利用同源建模方法預(yù)測了PhaC1437的3D結(jié)構(gòu),然后通過分子動力學模擬和對接模擬,識別出20個潛在的有益突變位點。將這些突變體在體內(nèi)進行測試后,發(fā)現(xiàn)PhaC1437(T259G)、PhaC1437(M495E)和PhaC1437(N469Q)三個突變體在poly(PhLA)的積累方面優(yōu)于原始PhaC1437。進一步的分析表明,這些突變位點都位于活性位點附近,但并未直接位于PhLA-CoA的結(jié)合界面。這些突變可能通過改善酶的熱穩(wěn)定性或擴大底物結(jié)合口袋來提高催化效率。

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為進一步提高poly(PhLA)的生產(chǎn),研究人員進行了突變組合,發(fā)現(xiàn)PhaC1437(T259G/M495E)雙突變體在流加培養(yǎng)發(fā)酵中可以產(chǎn)生最高32.05±1.47 wt%的poly(PhLA)。此外,通過優(yōu)化供料策略和代謝工程,研究人員還進一步提高了PhLA和poly(PhLA)的生產(chǎn)水平,最高分別達到11.0 g/L和12.3±0.1 g/L,這是目前最高的報道水平。

四、提高聚(3HB-co-PhLA)的產(chǎn)量

為探索是否可以同樣提高poly(3HB-co-PhLA)的生產(chǎn)水平,研究人員構(gòu)建了3HB單元聚合的代謝通路,引入了C. necator的PhaA和PhaB兩種異源酶,可以將兩分子乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3HB-CoA。之前的研究表明,3HB-CoA可以與PhLA-CoA被PhaC1437共聚合成poly(3HB-co-PhLA)。

鑒于PhaC1437(T259G/M495E)是PhaC1437的改造突變體,研究人員預(yù)期它也能夠共聚3HB-CoA和PhLA-CoA。因此,他們構(gòu)建了TLF17BPAppTMAB菌株,在TLF17BPAppTM菌株的基礎(chǔ)上,額外表達了phaA和phaB基因。在流加培養(yǎng)發(fā)酵中,該菌株可以生產(chǎn)49.7±1.0 g/L的poly(3HB-co-13.7 mol% PhLA)和55.2±1.6 g/L的poly(3HB-co-19.7 mol% PhLA)。

進一步地,研究人員將之前最優(yōu)的poly(PhLA)生產(chǎn)菌株TLF17BPALppTM,也改造成了能夠生產(chǎn)poly(3HB-co-PhLA)的TLF17BPALppTMAB菌株。在流加培養(yǎng)發(fā)酵中,該菌株可以生產(chǎn)61.4±0.0 g/L的poly(3HB-co-11.7 mol% PhLA),這是目前報道的最高芳香聚酯產(chǎn)量。在30 L發(fā)酵罐中的放大試驗也驗證了該結(jié)果,可以生產(chǎn)40.5±1.1 g/L的poly(3HB-co-16.7 mol% PhLA)。

對所得到的聚合物進行了表征,發(fā)現(xiàn)其分子量分布、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和楊氏模量等性能指標,與商業(yè)聚合物如PBT相當,顯示了良好的材料特性。

這項研究成功實現(xiàn)了大腸桿菌對不相關(guān)碳源的芳香聚酯的代謝工程生產(chǎn),包括同源芳香族聚酯和芳香共聚酯,克服了之前芳香聚酯生產(chǎn)受限于單體供應(yīng)不足、聚合效率低、以及在非天然PHA生產(chǎn)菌中積累困難等問題。通過引入天然PHA生產(chǎn)菌的phasin蛋白、基因組工程重定向碳通量、理性改造PhaC酶等措施,大幅提高了芳香聚酯的生產(chǎn)水平,實現(xiàn)了目前最高的產(chǎn)量記錄。所生產(chǎn)的生物降解芳香聚合物具有廣泛應(yīng)用前景,可替代傳統(tǒng)芳香聚合物,并應(yīng)用于生物醫(yī)用領(lǐng)域,其中最高產(chǎn)量的poly(3HB-co-PhLA)有望替代PBT等常用塑料,而非晶態(tài)低分子量的poly(PhLA)則適合用于藥物遞送系統(tǒng);基于本研究建立的代謝工程菌株,還可進一步開發(fā)包含PhLA在內(nèi)的各種新型芳香共聚酯,滿足不同應(yīng)用需求,具有廣闊的應(yīng)用前景,這項研究在芳香聚酯的生物合成和應(yīng)用方面取得了重要突破,為生物基可降解塑料的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。